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【求助】离子交换，30mM和100mM的PBS洗脱出目的蛋白，什么 意思？(5月

发布日期：2025-01-04 10:42    点击次数：106

RT直接用30mM洗脱，那30mM之前的蛋白不也跟着一起下来了吗？我该怎样理解？此句的前后文呢？没有前后文，只能猜，我猜想估计是离子交换层析中目的蛋白的馏分在３０－１００mＭ之间吧．GEHealthcare wrote:此句的前后文呢？The protein solution was applied to a column(5 cm X 100 cm) of DEAE-cellulose and washed with 10 mMsodium phosphate buffer, pH 7.0. Then it was eluted with 6L of 30 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0, followed by100 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. Assay for enzymeactivity showed the presence of two peaks of enzyme activity,one eluted by the 30 mM buffer and the other eluted by the100 mM buffer.The most active areas about eachpeak were pooled and labeled fractions A and B, respectively.此文的意思是：30mM 和 100mM 洗脱的组分都检测到酶活性，将两个组分分别收集，标记为组分A 和 B。至于两者是否为同一物质，并未说明。GEHealthcare wrote:此文的意思是：30mM 和 100mM 洗脱的组分都检测到酶活性，将两个组分分别收集，标记为组分A 和 B。至于两者是否为同一物质，并未说明。嗯，谢谢。那回到我的问题初衷：我先用10mM，直到检测到的蛋白组分基线水平。然后我直接换30mM的洗脱？是这意思吗？正确。这是常用的生产方法，简单，便于操作，也不需要复杂的梯度生产系统，手动的或简单的自动系统就可完成。GEHealthcare wrote:正确。这是常用的生产方法，简单，便于操作，也不需要复杂的梯度生产系统，手动的或简单的自动系统就可完成。稍微明白了，谢谢。我在AKTA上操作。1）意味着直接用30mM洗脱，直到与基线平行，最后只收集那些有活性的收集管？还是，收集全部的收集管？2）我想改用某浓度的NaCl+10mM PBS混合洗脱，那摸索处具体的洗脱浓度怎么就那么难那？我是这样做的，先用0.5mM NaCl+10mM PBS梯度洗脱，然后看哪个洗脱浓度（当然通过电导得出的洗脱浓度）下比活性大，就选取哪个浓度作为洗脱。问题是，我现在用100mM的PBS梯度洗脱得不到文献上所说的那两个浓度，而是只有一个洗脱峰，这个洗脱峰里比活性最大的2个电导处，非文献上所说的30mM和100mM，怎么解释呐？谢谢这个问题回答起来话就长了！简单说来，任何吸附都不是绝对的，即，它是一个吸附和解离的动态平衡。当吸附力强时，显示为吸附状态，当外界条件变化，导致解离力强时，则显示为被洗脱 。而我们变化条件，进行洗脱时，都是一个渐变过程，（即使你的程序是直接的变化，如由10mM变成30mM），而渐变的过程不一样，看到的结果肯定不同，但是是可以通过分析来解释的。就具体你的梯度和阶段洗脱的显示浓度不一致，原因为，在梯度洗脱中，当到达一个浓度，蛋白可以被洗脱时，此时蛋白质开始和介质解离，但梯度却还在继续升高，所以，伴随蛋白一起流到检测器的溶液的盐浓度，通常都大于真正所需的洗脱盐浓度。解决办法是，在方法摸索时，尽量减缓梯度变化的速度，有时 甚至会走20-40个柱床的梯度长度。还有很多影响因素，需要学习一下相关的专业书籍，恕我不能一一表述噢哦噢。在走10~20个柱床体积时是两个活性高的峰。但我有一次跑了大约40个柱床体积，一侧活性，做出图类一看，一个大大的拱桥。我都无言加无奈死了。感觉老天总在跟我开玩笑此乃文献的结果。注：(实线) Protein concentration; (虚线) amine oxidase activity. Buffer changes are depictedby arrows. Twenty-two-milliliter fractions were collected.实线为蛋白浓度，虚线为活性 。横坐标代表什么？洗脱体积？ screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=454 title="Click to view full 1.JPG (802 X 569)" border=0 align=absmiddle>而我得到的是这个。我在30mM PB洗脱时却有拖尾，为什么？ screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=445 title="Click to view full 2.JPG (1024 X 712)" border=0 align=absmiddle>Fraction Number 代表分步收集的收集管数，每管收集一定体积，然后换下一管，文献里应该还会谈到Fraction Volume。分步收集可以手动或用分步收集器。一般，GE的系统都可以配分步收集器，很多老的国产的层析系统也有。分布收集目的不外乎两个：1.以前很多实验室没有在线的紫外检测器，层析就是一个蠕动泵，一个柱子，所以用分步收集，每个管子收集一定体积流出液，再挨个管子测浓度和活性。2.现在的分布收集一般是用于层析条件的摸索，比如说慢慢走梯度等，就是。对照收集管的号和图中的UV、电导等，确定蛋白主要集中于那些收集管，然后测活。至于你的脱尾，我感觉是柱子的问题，要是那样的话，脱尾不代表有杂蛋白。要是自己买填料装的，那就重装一下试试。当然，为保险也可以不要脱尾的部分，反正蛋白也不多，谢谢楼上的。新问题：我用30mM PB洗脱，然后接着换上100mM PB去洗脱，岂不是30～100mM PB之间的杂蛋白跟着我的目的蛋白一起下来了呀？这跟我直接用100mM PB洗脱的效果不一样吗？谢谢[color=red][/color]mhtzqp wrote:谢谢楼上的。新问题：我用30mM PB洗脱，然后接着换上100mM PB去洗脱，岂不是30～100mM PB之间的杂蛋白跟着我的目的蛋白一起下来了呀？这跟我直接用10mM PB洗脱的效果不一样吗？谢谢[color=red][/color]你可能是笔误，10mM应该是100mM吧！如果，30mM和100mM都是你要的目的物，那，对的，用100mM直接洗脱，效果是一样的。GEHealthcare wrote:你可能是笔误，10mM应该是100mM吧！如果，30mM和100mM都是你要的目的物，那，对的，用100mM直接洗脱，效果是一样的。谢谢我最近根据您的建议做了一次实验，效果不错。如图： screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=556 height=595 title="Click to view full 过deae上样2ml SSAO酶活性测定1st B为0.03M和0.1M PB 阶段洗脱.JPG (556 X 595)" border=0 align=absmiddle>现在我想把B液换为0.5M NaCl+0.01M PB，梯度洗脱。作出的结果为图。请问，这两种B液可以互换嘛？ screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=314 title="Click to view full 号兔血浆过deae上样2ml SSAO酶活性测定1st B为0.5M NaCl 梯度洗脱.JPG (916 X 450)" border=0 align=absmiddle>其实用哪种盐洗脱是没有什么区别的，只要相对应的离子强度一样，洗脱效果应该差不多。你用100mM PB，离子强度=0.1*3**2=0.9。 0.5 M NaCl +0.01MPB 离子强度=0.5*1**2+0.01*3**2=0.59。所以洗脱效果不如100mMPB，相当于60mM左右的PB。蛋白可能还没完全洗脱下来.ronan0625 wrote:其实用哪种盐洗脱是没有什么区别的，只要相对应的离子强度一样，洗脱效果应该差不多。你用100mM PB，离子强度=0.1*3**2=0.9。 0.5 M NaCl +0.01MPB 离子强度=0.5*1**2+0.01*3**2=0.59。所以洗脱效果不如100mMPB，相当于60mM左右的PB。蛋白可能还没完全洗脱下来.thanks. 新问题：我想做完一次，接着按说明书上的Regeneration,就上下次样品，这样可以吗？Regeneration is normally performed by washing with a high ionic strength buffer (e.g. start buffer containing 1-2 M NaCl) and/or changing pH, followed by re-equilibrating in starting buffer. Regeneration can be carried out at flow rates of 8-10 ml/min. Monitor the UV absorbance during regeneration to determine when bound substances have been completely washed out of the column. In some applications, substances such as denatured proteins or lipids do not elute in the regeneration procedure. These can be removed by cleaning-in-place procedures."还是需要再进一步的在位清洗再上下次样品呐？ Cleaning-in-place (CIP)Remove ionically bound proteins by washing the column at 1-1.5 ml/min in a reversed反向flow direction with 10 ml of a 2 M NaCl solution, contact time接触时间 10-15 minutes.Remove precipitated proteins, hydrophobically bound proteins and lipoproteins by washing the column in a reversed flow direction with 100 ml 1 M NaOH solution at a flow rate of 1.2-1.4 ml/min. Remove strongly hydrophobically疏水的 bound proteins, lipoproteins and lipids by washing the column in a reversed flow direction with 80 ml of 70% ethanol or 30% isopropanol异丙醇 at a flow rate of 1.2-1.4 ml/min. Apply increasing concentration gradients to avoid air bubble formation, when using high concentrations of organic solvents有机溶剂. After cleaning the column, equilibrate with approximately 100 ml of start buffer before use. ronan0625不一定需要在位清洗，而且如果是sepharose凝胶的话，次与次之间的清洗不用这么麻烦啊。看看柱子的颜色有没有变深，柱压有没有增大，要是没有明显的变化，可以就只用0.5或1NaOH冲5个柱体积就行了。要是这样做不行就按说明书得来。